利用基因转移技术进行苹果品种遗传改良，拓宽了基因源、突破了种间界限，可缩短育种周期、提高育种效率，并有望实现定向育种，为苹果遗传育种研究、优异种质资源利用开辟了一条新的技术途径，展现了良好的前景。外源目的基因转入植物基因组后，能否在受体植物中稳定表达及遗传是转基因植物商品化的首要条件(任江萍等, 2006)，这就需要不断观察和检测转基因植株及后代的表现。James等(1996)研究了外源基因在“绿袖”中的表达情况及其在后代中的遗传规律，发现nos基因和nptⅡ基因在转基因植株的果实中得到稳定表达。郭培鑫等(2011)研究发现Bt基因和nptⅡ基因在8年生毛白杨植株内稳定存在。但是外源基因进入受体后由于拷贝数大小不一、插入位点不定、整合的DAN结构变异大和外界的环境的一些诱导因素等会导致外源基因在受体植物中的失活、沉默、丢失等现象，从而影响了外源基因在受体植物及其后代的稳定性(赵彦平和赵春海, 2011)。有研究表明，在44个转基因烟草株系中的自交一代有5个转基因株系的外源基因表现丢失(Budar et al., 1986)；外源Cry1Ac抗虫基因与nptⅡ基因在转基因棉花F₁代中稳定存在且稳定表达，但在F₂代检测样本中5%的个体出现基因沉默，还有一株未检测到Cry1Ac基因(曾潜等, 2011)。外源基因在受体植株中的稳定性遗传很复杂，需要不断检测和观察。

转基因植株离体保存需借助植物组织培养方法，在多次继代培养过程中，培养材料可能会发生变异，如香蕉(朱靖杰, 1995, 果树科学, 12(2): 120-122)、草莓(Swartz et al., 1981)、番木瓜(李卫东等, 2006)的离体培养后代有明显的变异，且随继代次数的增加，变异机率会大大增加，朱靖杰和李卫东分别提出，香蕉、番木瓜离体培养代数应控制在10代和32代内。经过多代培养的转基因组培苗还涉及外源基因是否丢失的问题，周瑞金等(2011)研究证明外源基因在继代培养6~8年的组培苗中稳定存在，并在大部分株系中表达。

本研究进一步对继代保存了13年的转基因苹果组培苗和定植了6~8年的田间转基因植株中外源基因的遗传和表达进行研究，为转基因作物的应用和离体保存提供依据。

1结果与分析
1.1转基因苹果组培苗中外源nptⅡ基因检测
携带nptⅡ基因的转基因植株具有抗卡那霉素(Kan)特性，分别将转基因株系与非转基因组培苗新梢接种在添加Kan 50 mg/L的继代培养基上，生长50 d后，未转基因的对照组培苗白化甚至整株死亡，转基因嘎拉、王林、乔纳金及富士组培苗全部生长正常，与在无Kan的培养基上的分化生长状况完全一致，未出现白化或花叶现象(表1)。表明标记基因nptⅡ在嘎拉、王林、富士、乔纳金常规继代培养13年的转化株系组培苗中稳定存在并可以正常表达。

表1 长期继代培养的转nptⅡ基因苹果组培苗卡那霉素抗性分析 Table 1 Kanamycin resistance analysis in transgenic lines of apple plantlets carrying nptⅡ gene and subcultured for years

1.2转基因苹果组培苗中外源CpTI基因检测
分别提取继代培养13年的转基因苹果4个品种57个转化株系的组培苗DNA，以CpTI质粒DNA为阳性对照，非转化植株基因组DNA为阴性对照进行PCR扩增，依扩增出的特异条带有无来检测外源CpTI基因的存在情况。结果表明，所有转基因植株和阳性对照得到一条大小为326 bp的均一条带，阴性对照未出现该特征带(图1; 图2)。说明外源CpTI基因在苹果转基因组培苗中，经过离体继代培养13年依然稳定存在。}

 

图1 转CpTI基因王林苹果组培苗PCR检测结果 注: M: 2 000 bp marker; 1: CpTI质粒; 2~9: 转化株系; 10: 非转基因植株 Figure 1 PCR analysis of CpTI gene in transgenic plantlets in vitro of Orin apple Note: M: 2 000 bp marker; 1: CpTI plasmid; 2~9: Transgenic plantlets; 10: Non-transgenic control

图2 转CpTI基因嘎拉、乔纳金、富士苹果组培苗PCR检测结果 注: M: 2 000 bp marker; 1~3: 嘎拉转化株系; 4~6: 乔纳金转化株系; 7~8: 富士转化株系; 9: CpTI质粒; 10: 非转基因植株 Figure 2 PCR analysis of CpTI gene in transgenic plantlets in vitro of Gala, Jonagold, and Fuji apple Note: M: 2 000 bp marker; 1~3: Transgenic Gala; 4~6: Transgenic jonagold; 7~8: Transgenic Fuji; 9: CpTI plasmid; 10: Non-transgenic control

1.3田间转化植株叶片中外源CpTI基因的PCR检测
采集田间转基因苹果45个株系的叶片并提取DNA，以CpTI质粒为阳性对照，非转化田间植株叶片基因组DNA为阴性对照，进行PCR扩增，结果显示所有转化株系均得到明显的特异性条带，片断大小326 bp；阴性对照没有检测到该特征带(表2; 图3)。说明转基因苹果在自然生长环境下，外源CpTI基因能在转基因植株叶片中稳定存在。

表2 田间转基因苹果叶片外源CpTI基因的PCR分析 Table 2 PCR analysis of CpTI gene in leaves of transgenic apple plants cultivated in field

图3 田间转基因苹果叶片外源CpTI基因PCR检测 注: M: 2 000 bp marker; 1~8: 嘎拉转化株系; 9: CpTI质粒; 10: 非转基因植株; 11~14: 王林转化株系; 15~16: 乔纳金转化株系; 17: 富士转化株系 Figure 3 PCR analysis of CpTI gene in leaves of transgenic apple plants cultivated in field Note: M: 2 000 bp marker; 1~8: Transgenic Gala; 9: CpTI plasmid; 10: Non-transgenic control; 11~14: Transgenic Orin; 15~16: Trans- genic Jonagold; 17: Transgenic Fuji

1.4田间转化植株根系中外源CpTI基因的PCR检测
提取田间转基因苹果43个株系的根系DNA，进行PCR扩增检测(表3)。结果显示王林3个株系、富士1个株系均表现PCR阳性；嘎拉39个株系中有2个株系未显示CpTI基因的特异性条带(表3; 图4)，PCR阳性率94.9%。说明外源CpTI基因在极少部分田间苹果转基因植株根系中有丢失，可能是不定根诱导过程中造成了外源基因丢失。

 

表3 田间转基因苹果根系外源CpTI基因的PCR分析 Table 3 PCR analysis of CpTI gene in roots of transgenic apple plants cultivated in field

图4 田间转基因苹果根系外源CpTI基因PCR检测 注: M: 2 000 bp marker; 1~9, 11~16: 嘎拉转化株系; 10: CpTI质粒; 17: 非转基因嘎拉 Figure 4 PCR analysis of CpTI gene in roots of transgenic apple plants cultivated in field Note: M: 2 000 bp marker; 1~9, 11~16: Transgenic Gala; 10: CpTI Plasmid; 17: Non-transgenic control

1.5田间转化植株花粉中外源CpTI基因的PCR检测
采集转基因嘎拉苹果29个株系的花粉并提取DAN，以CpTI质粒为阳性对照、非转化田间植株花粉基因组DNA为阴性对照进行PCR扩增，结果29个转化株系都得到特异性条带，而阴性对照没有检测到该条带，说明外源CpTI基因可存在于田间转化株系的花粉中(图5)。

图5 田间转基因嘎拉苹果花粉中外源CpTI基因PCR检测 注: M: 2 000 bp marker; 1~8: 嘎拉转化株系; 9: 非转基因植株; 10: CpTI质粒 Figure 5 PCR analysis of CpTI gene in pollen grains collected from transgenic Gala apple plants cultivated in field Note: M: 2 000 bp marker; 1~8: Transgenic Gala; 9: Non-transgenic control; 10: CpTI plasmid

2讨论
外源基因的遗传稳定性，一方面是受体细胞愈伤组织诱导、不定芽分化、不定根形成过程中的稳定性，也就是转化植株在组培条件下无性繁殖的稳定性；另一方面是外源基因在植物有性繁殖过程中的遗传稳定性，即田间植株经历萌芽、生长、开花、减数分裂、授粉受精、合子形成及胚的发育等一系列复杂过程后，外源基因在后代的遗传表现(金万梅等, 2005)。

 体细胞无性系变异是一种普遍现象，经过多代繁殖的组培苗尤其是通过不同器官、不同途径再生的试管苗后代会在形态学、细胞学及遗传物质(DNA)等方面存在不同程度的变异，这可能既有植物本身固有特性在一定条件下的表现，也有离体培养下的诱导使基因改变(伊华林, 2002)，转化植株在多次继代繁殖保存过程中可能会出现目的基因的丢失或沉默。本研究分别对保存了13年，经过约100多次继代培养的转基因苹果4个品种57个转化株系组培苗进行了外源基因的检测，结果所有转基因株系组培苗均含有外源nptⅡ和CpTI基因，这与6年前的检测结果一致(周瑞金等, 2011)，说明外源基因可以在长期保存的继代组培苗中稳定存在。

研究中还分别检测了定植了6~8年的田间转化植株中叶片、根系、花粉等器官中CpTI基因的存在，结果表明：供试转化株系叶片和花粉中CpTI基因均稳定存在，这与曾凡锁等(2008)对转基因白桦中外源基因(bgt基因, gus基因, nptⅡ基因)的检测结果一致；而极少部分株系的根系中未检测到外源基因。部分转化株系的根系PCR检测呈阴性，分析其原因可能与不定根发生有关。本研究中所用田间转化株系的根系是由组培新梢诱导不定根而来，组培生根过程中一些靠近韧皮部的薄壁细胞受到诱导刺激发生定向的细胞分裂，形成与初生根根原基相似的不定根根原基，其过程主要包括诱导细胞的脱分化、细胞分裂以及扩大形成分生组织、从根原基上再产生根并生长，外源基因的插入可能会导致细胞分裂过程的异常，从而造成外源基因的丢失(李小方等, 2001, 细胞生物学杂志, 23(3): 130-136)。

3材料与方法
3.1植物材料
供试组培苗为苹果(Malus domestica Borkh.)品种嘎拉、王林、乔纳金、富士及4个品种57个株系的转CpTI基因(含nptⅡ基因)苹果组培苗，其中转基因嘎拉45个株系，王林7个株系，乔纳金3个株系，富士2个株系，1998年由河北农业大学园艺学院生物技术实验室培育，继代保存至今已13年。继代培养基MS+0.75 mg/L 6-BA+0.04 mg/L NAA+35 g/L白砂糖+6.5 g/L琼脂，pH 5.8~pH 6.0；培养条件：培养温度：(25±2)℃，光照强度：1 500~2 000 lx，光照周期：14 h光照/10 h黑暗，6~8周继代1次。

供试田间植株为2004~2006年定植于河北农业大学园艺学院标本园内的上述4个苹果品种的转CpTI基因和非转基因的自根植株。

3.2转基因苹果组培苗卡那霉素抗性检测外源nptⅡ基因的稳定性
取常规继代培养的转CpTI基因苹果株系和非转化植株组培苗新梢，分别接种在不加Kan或附加Kan 50 mg/L的继代培养基(MS+0.75 mg/L 6-BA+0.04 mg/L NAA+35 mg/L白砂糖+6.0 mg/L琼脂)中，每株系接种3瓶，每瓶接种7株。40 d后调查在不同培养基上转化植株与非转化植株的生长及白化情况。

3.3转基因苹果组培苗的PCR扩增检测外源CpTI基因的稳定性
参照杜国强等(1999)方法提取苹果组培苗DNA，SDS法提取农杆菌质粒DNA (萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)。扩增引物为：5'-GATGATGGTGCTAAAGGTGT-3'，5'-CTTACTCATCATCTTCATCC-3'，由大连宝生物工程有限公司合成。采用美国BIO-RAD公司的MyCycler^TM PCR仪扩增，反应程序为94℃预变性6 min，扩增30次循环，每循环包括94℃变性60 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s；最后72℃再延伸 10 min，扩增目的片段大小为326 bp。取PCR扩增反应产物5 μL琼脂糖电泳检测，Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统仪观察结果并照相。

3.4田间苹果转基因植株各器官中外源CpTI基因的检测
从田间采集转化植株和非转化植株的叶片、根系，并于气球期采摘转基因植株和对照植株的花朵，室内脱药，除杂，散放于培养皿中硫酸纸上，干燥、散粉后，用于DNA提取和PCR扩增。

作者贡献
王倩倩和常腾飞是本研究的试验设计和研究的直接实施者；师校欣和杜国强是项目的构思者及负责人，参与试验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终文本。

致谢
本研究由河北省自然基金项目(C2012204091, C2006000451)资助。

参考文献
Budar F., Thia-Toong L., Van Montagu M., and Hernalsteens J.P., 1986, Agrobacterium-mediated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single mende- lian factor, Genetics, 114(1): 303-313

Du G.Q., Shi X.X., Ma B.K., and Zhang W.C., 1999, A suitable procedure for extracting genomic DNA from plantlet of apple in vitro, Hebei Nongye Daxue XueBao (Journal of Agricultural University of Hebei), 22(3): 42-43 (杜国强, 师校欣, 马宝焜, 章文才, 1999, 一种适宜苹果组培苗的DNA提取方法, 河北农业大学学报, 22(3): 42-43)

Guo P.X., Zhang J., Liu Z.H., and Pang X.B., 2011, Investigation of arthropod community and the stability of insect-resistance of the triploid Chinese white poplar transformed with two insect-resistant genes, Hebei LinguoYanjiu (Hebei Journal of Forestry and Orchard Research), 26(1): 58-62 (郭培鑫, 张军, 刘朝华, 庞新博, 2011, 转抗虫基因三倍体毛白杨成年树木节肢动物及抗虫稳定性调查, 河北林果研究, 26(1): 58-62)

James D.J., Passey A.J., Baker S.A., and Wilson F.M., 1996, Transgenes display stable patterns of expression in apple fruit and mendelian segregation in progeny, Nature Biotechnol., 14(6): 56-60

Jin W.M., Pan Q.H., Yin S.P., Dong J., Jiang L.J., Yang L., Chen Q.H., and Zhao J.B., 2005, Progress of the genetic stability and breeding behavior of foreign gene in genetically modified plants, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 3(6): 864-868 (金万梅, 潘青华, 尹淑萍, 董静, 姜立杰, 杨丽, 陈青华, 赵剑波, 2005, 外源基因在转基因植物中的遗传稳定性及其转育研究进展, 分子植物育种, 3(6): 864-868)

Li W.D., Wang D.M., Li X.Y., Wu T.G., and Zhou P., 2006, Study on the genetic stability of Carica papaya (caricaceae) pripagating plantlets through cytological approach, Yunnan Zhiwu Yanjiu (Acta Botanica Yunnanica), 28(6): 645-648 (李卫东, 王东梅, 黎小瑛, 吴廷广, 周鹏, 2006, 用细胞学方法研究番木瓜组培苗的遗传稳定性, 云南植物研究, 28(6): 645-648)

Ren J.P., Yin J., and Wang X.G., Wang Z.Y., Chen H.L., 2006, Inheritance and phenotype analysis of Anti-trxs gene and Bar gene in transgenic wheat, Xinan Nongye Xuebao (Southwest China Journal of Agricultural Sciences), 19(1): 10-13 (任江萍, 尹钧, 王新国, 王振云, 陈焕丽, 2006, Anti-trxs和Bar基因共转化小麦后代植株的遗传及表型分析, 西南农业学报, 19(1): 10-13)

Swartz H.J., Gene J.G., and Zimmerman R.H., 1981, Field performance and phenotypic stability of tissue culture-propagated strawberries, J. Am. Soc. Hortic. Sci., 106(5): 667-673

Sambrook J., and Russell D.W., eds., Huang P.T., trans., 2002, Molecular cloning: a laboratory manual, Science Press, Beijing, China, pp.138 (萨姆布鲁克 J., 拉塞尔 D.W., 编著, 黄培堂, 主译，2002, 分子克隆实验指南, 科学出版社, 中国, 北京, pp.138)

Yi H.L., 2002, Somaclonal variation of fruit crops and cultivar improvement, Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant Physiology Communication), 38(4): 412-416 (伊华林, 2002, 果树体细胞无性系变异与品种改良, 植物生理学通讯, 38(4): 412-416)

Zeng F.S., Wang X.F., Luo W., and Zhan Y.G., 2008, Analysis of pollen vigor, inheritance and expression of foreign genes in transgenic birch (Betula platyphylla Suk.) pollen, Zhiwu Shenglixue Tongxu (Plant Physiology Communication), 4(6): 1082-1086 (曾凡锁, 王晓风, 骆薇, 詹亚光, 2008, 转基因白桦的花粉活力及外源基因的遗传表达分析, 植物生理学通讯, 4(6): 1082-1086)

Zeng Q., Zhang X.W., Peng Z.Z., Huang L.H., Chen H.B., and Bai K., 2011, Expression and genetic stability of insect resistant gene in F1 and F2 of Xiangzamian No.22, Hunan Nongye Kexue (Hunan Agricultural Sciences), 14(13): 5-7, 10 (曾潜, 张学文, 彭珍子, 黄丽华, 陈浩东, 戴恺, 2011, 抗虫基因在湘杂棉22号F1与F2代中的表达及遗传稳定性研究, 湖南农业科学, 14(13): 5-7, 10)

Zhao Y.P., and Zhao C.H., 2011, Research and analysis of transgenic breeding in plants, Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Bulletin), 12(3): 73-76 (赵彦平, 赵春海, 2011, 植物转基因育种的分析与研究, 生物技术通报, 12(3): 73-76)

Zhou R.J., Du G.Q., and Shi X.X., 2011, Study on stability of exogenous gene in transgenic apple plantlets, Dongbei Nongye Daxue Xuebao (Journal of Northeast Agricultural University), 42(7): 97-101 (周瑞金, 杜国强, 师校欣, 2011, 外源基因在苹果植株中稳定性研究, 东北农业大学学报, 42(7): 97-101)